免疫原性检测抗体纯化—离心、过滤

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　离心、过滤
　　免疫原性检测抗体为胞外分泌型表达，纯化的第一步是将培养液上清与细胞及细胞碎片分离开来。在实验室规模，分离可通过简单批次离心完成，但大规模抗体生产主要采用连续分离的方法，主要包括深层过滤、切向流过滤和连续流离心。
　　深层过滤的优点是简单易用，前期投入低。深层过滤介质的孔径分布较广，内表面积大，可依靠孔径截留和内表面吸附双重作用去除固体颗粒，比单一孔径滤器能处理更大量的固体杂质，且流速更快。
　　深层过滤系统由一系列的滤器组成，介质的孔径从上游到下游递减（见下图）。深层过滤本身不能达到无菌过滤，所以过滤系统的最后一级通常需要一个无菌滤器。深层过滤介质中含有硅藻土，硅藻土在抗体纯化条件下带正电荷，在去除细胞和细胞碎片的情况下，还可以去除部分带负电荷的宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白质，起到初步纯化的作用。
　　深层过滤的缺陷是一次性滤芯使用费用高和处理量有限，在处理大体积培养液时需并联多个滤器，费用和占地面积显著增加，所以深层过滤的试用范围限于100-2000L的中试规模的抗体纯化。
　　切向流滤器在灌流反应器部分较为常用（见下图），其高切向的流速可减少细胞在膜表面的沉积，从而可以处理大体积细胞培养液而不造成膜的堵塞。
　　切向流的流速越高，细胞沉积越少，但同时带来的剪切力越高，细胞破碎风险越大。细胞破碎形成的细胞碎片更容易阻塞滤芯，并且细胞破碎释放的胞内蛋白和核酸将大大增加后续纯化步骤的压力。
　　切向流滤器的使用以中空纤维最为普遍，其表面积大，又可以在孔腔内形成高剪切力。中空纤维滤器的工艺放大可通过增加纤维数目完成，简单易行。
　　在切向流过滤工艺开发和优化方面，需要考虑的包括滤芯化学成分、滤芯表面积、孔径、切向流流速、跨膜压力。
　　切向流过滤存在死体积，可在过滤后期加人少量缓冲液，降低死体积中的抗体含量，减少抗体损失。切向流过滤处理量大，可用于超过10000L细胞培养的分离，达到每小时近5000L的液体处理量。其局限在于滤器费用较高，过滤时间较长，并且过滤速度的可控性低。
　　连续流离心，尤其是采用碟片式离心机进行的连续流离心，是大规模抗体生产中主要采用的分离模式。
　　碟片式离心机腔体为锥形，细胞培养收获液在靠近轴部加入，离心后上清液从轴部附近排出，细胞在离心力作用下，在锥形的底部边线附近聚集结块。
　　腔体定期在细胞聚集处轻微开启，利用腔体内的压力将细胞排出。细胞排出夹带的液体损失可通过离心力（转速）、腔体开启频率和开启时间的优化，控制在5%以下。
　　连续流离心能够去除绝大部分细胞和细胞碎片。残留的少量细胞碎片可用深层过滤去除。碟片式离心机的优点是体积小，多层碟片形成的沉降面积大，液体处理量大，操作简单、可靠，使用费用低。其缺点是前期设备投资髙，清洗较复杂，并缺少合适的小试模型。
　　连续流离心机与沉降器一样利用细胞与培养基的密度差实现固液分离。下图显示的是一个商业化的碟片式连续流离心机。细胞培养液自离心机底部进料，在离心力的作用下，细胞在腔体的最外围富集。
　　上下腔体周期性地短暂打开，释放清除腔体内积累的细胞，这部分细胞返回反应器。细胞培养液上清自离心机顶端收获。连续流离心分离速度快，液体处理量大，可实现高达3600L/d的灌流速度，细胞分离效果高于90%，有很好的应用前景。
　　连续流离心机的弱点是设备和操作相对复杂，机械和操作故障风险相对较高。同时离心时形成的细胞团有可能造成局部营养缺失或副产物积累，其程度和影响需进一步考察。连续流离心机在操作时还需考虑细胞的剪切力耐受性，避免细胞损伤。