基因测序2——二代测序各技术平台原理及市场解读

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　　基因测序系列，将聚焦基因测序设备，系统分析一代、二代、三代基因测序设备的技术原理，二代测序平台代表厂家，仪器特点以及未来趋势。本篇从技术原理、产品特点、公司现状、市场等方面，深入分析二代测序的三大代表技术：Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术。

　　第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。

　　Roche公司454技术

　　1、技术原理

　　Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理如下图 abc所示。

　　(1)DNA文库制备

　　利用超声或者氮气喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同接头分A、B两种，即各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp (TCAG)的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素(Biotin)标记，用于磁珠纯化步骤。待测DNA进行 PCR扩增，并构建单链DNA文库(图1.a)。

　　(2)emPCR(乳液PCR)

　　454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与直径约28um的测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水(water-in-oil)的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器中将只包含一个磁珠和一条单链DNA,通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段依然结合在磁珠上。